在腦科學(xué)領(lǐng)域,，針對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的機(jī)制和治療研究離不開對(duì)大腦結(jié)構(gòu)和功能的深入了解。對(duì)全腦進(jìn)行整體成像能夠幫助研究者從宏觀尺度探究不同生理和病理狀態(tài)下的大腦結(jié)構(gòu)與功能差異。通過物理化學(xué)方法，在保留組織和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的前提下,，讓生物組織變得透明，從而實(shí)現(xiàn)熒光3D成像,，是目前最為直接有效的技術(shù)手段,。然而，由于受到多種因素的干擾,，組織透明化后的免疫熒光染色仍是領(lǐng)域內(nèi)的難點(diǎn)問題之一,。
圖一：TSA-PACT方法流程圖
2023年5月26日，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系熊博課題組與協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科孫暉課題組合作在美洲華人生物學(xué)家協(xié)會(huì)官方學(xué)術(shù)期刊Cell & Bioscience (IF=9.584)上在線發(fā)表了題為TSA-PACT: a method for tissue clearing and immunofluorescence staining on zebrafish brain with improved sensitivity, specificity and stability的研究論文,。該研究基于PACT技術(shù),，開發(fā)了以TSA熒光催化與放大體系為特征的透明組織整體熒光成像新方法。通過優(yōu)化后的簡(jiǎn)便的操作,，使斑馬魚大腦整體透明化,，利用少量的抗體即可完成斑馬魚全腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)三維標(biāo)記。此外,，該方法顯著提高了熒光信號(hào)的強(qiáng)度及信噪比,，獲得了清晰的神經(jīng)元形態(tài)和分布；利用TSA底物與丙烯酰胺水凝膠網(wǎng)絡(luò)共價(jià)結(jié)合的特性,，增加了信號(hào)標(biāo)記的穩(wěn)定性,，實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的長(zhǎng)久保存，放置16個(gè)月以上的組織仍然能夠進(jìn)行清晰的重復(fù)成像,，并允許多輪熒光標(biāo)記操作,，滿足多種成像的需求。作為對(duì)該方法的驗(yàn)證,，課題組使用該技術(shù)進(jìn)行了神經(jīng)纖維,、神經(jīng)元胞體、浦肯野纖維網(wǎng)與星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記與熒光成像,，呈現(xiàn)出良好的標(biāo)記效果,，提供了豐富的可視化信息，適用于腦精細(xì)結(jié)構(gòu)分析,、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)繪制和三維細(xì)胞計(jì)數(shù),。通過使用HuC/D與GFAP抗體共同標(biāo)記，可從三維尺度觀測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元的相對(duì)空間位置,，探索其相互作用,。通過全腦三維增殖期細(xì)胞計(jì)數(shù)，驗(yàn)證了高糖環(huán)境對(duì)發(fā)育期斑馬魚大腦細(xì)胞增殖的抑制作用,，證明了TSA-PACT技術(shù)在疾病研究中的潛在應(yīng)用價(jià)值,。
圖二：全腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),，細(xì)胞定位，三維細(xì)胞計(jì)數(shù)
值得一提的是,，本項(xiàng)目的開展起始于本科生創(chuàng)新項(xiàng)目“基于PACT技術(shù)的斑馬魚組織透明化實(shí)驗(yàn)體系的建立與應(yīng)用”,。2019年初，八年制臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)大三年級(jí)學(xué)生余雨欣和徐銀慧同學(xué)申報(bào)了相關(guān)大創(chuàng)項(xiàng)目并獲批,。經(jīng)過一年的研究訓(xùn)練,，項(xiàng)目取得了初步進(jìn)展并順利結(jié)題。然而當(dāng)時(shí)仍有許多技術(shù)細(xì)節(jié)需要進(jìn)一步完善,。此后三年時(shí)間里,，兩位同學(xué)在博士生王康的幫助下,，在熊博教授和孫暉教授的指導(dǎo)下,，繼續(xù)利用課余時(shí)間反復(fù)研究，不斷優(yōu)化實(shí)驗(yàn)流程,，終于取得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。而后，余雨欣和徐銀慧同學(xué)全程參與了數(shù)據(jù)的整理,，論文的寫作,、投稿、補(bǔ)實(shí)驗(yàn),、返修等過程,，獲得了充分的科研訓(xùn)練，并實(shí)現(xiàn)了將大創(chuàng)項(xiàng)目的成果發(fā)表在學(xué)術(shù)期刊上的目標(biāo),。華中科技大學(xué)熊博教授和孫暉教授為本論文的共同通訊作者,，法醫(yī)學(xué)系王康博士（現(xiàn)為南京醫(yī)科大學(xué)專任教師）、八年制臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)余雨欣和徐銀慧為該論文的共同第一作者,。該研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金,、華中科技大學(xué)創(chuàng)新研究院技術(shù)創(chuàng)新基金和江蘇省高等學(xué)校自然科學(xué)研究基金的支持。
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https://cellandbioscience.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13578-023-01043-1
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