微生物能夠產(chǎn)生多種具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物，例如DNA嵌入劑,。然而,，由于傳統(tǒng)活性測試的靈敏度和專一性存在局限，尋找新的DNA嵌入劑依然是一項挑戰(zhàn),，這通常涉及到大規(guī)模的發(fā)酵和提純過程,。對單個DNA分子的力學操縱拓展了我們對DNA的物理特性、DNA與小分子化合物相互作用的深入理解,。從微生物中發(fā)掘DNA結(jié)合化合物是抗腫瘤藥物發(fā)現(xiàn)的重要來源,。單分子生物物理技術(shù)與天然產(chǎn)物化學的結(jié)合，以及合成生物學技術(shù)新的融合,，為活性天然產(chǎn)物的發(fā)掘帶來了新的可能,。
近日，華中科技大學同濟醫(yī)學院藥學院蔡曉鳳教授和游慧娟教授團隊合作,，在學術(shù)期刊Nucleic Acids Research發(fā)表了題為“Force-enhanced sensitive and specific detection of DNA-intercalative agents directly from microorganisms at single-molecule level”的研究論文,，本研究介紹了單分子操縱技術(shù)直接在微生物培養(yǎng)或提取中篩選產(chǎn)生DNA插入劑的微生物的開創(chuàng)性應用。
核酸結(jié)合的化療藥物如阿霉素,、柔紅霉素和喜樹堿等是癌癥治療的重要藥物,。據(jù)統(tǒng)計，從1949到2019年大約有17%已批準上市的抗腫瘤藥物為核酸結(jié)合化合物,，其中一半來源于微生物或者植物中所發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物,。部分微生物通過產(chǎn)DNA結(jié)合化合物可以獲得環(huán)境中的競爭優(yōu)勢。然而,，傳統(tǒng)的檢測方法受其靈敏度和特異性的限制,，很難從微生物中識別微量的此類化合物，通常需要大規(guī)模培養(yǎng)（>10升液體或者1千克固體培養(yǎng)）和復雜的分離純化,，才能得到微克級別的化合物進行進一步的分析鑒定,。
圖1. 單分子磁鑷應用于挖掘微生物來源的新型DNA嵌入劑。
單分子操縱技術(shù)如光鑷,、磁鑷,、原子力顯微鏡能夠?qū)崿F(xiàn)對單個DNA和蛋白分子的力學操縱,，并被廣泛運用于DNA和小分子化合物相互作用的研究中。然而,，此前的單分子技術(shù)并未用于復雜樣品的直接檢測,，如微生物和植物提取物。本研究首次證明了在無需純化的情況下,，可以直接從5微升菌液或者微生物粗提物中鑒定納摩爾級別的DNA嵌入劑,。該檢測基于DNA嵌入劑在受力時導致DNA末端長度增加的原理。這種DNA輪廓長度的增加是嵌入劑的特有現(xiàn)象,，受溶液的離子條件,，微生物初級代謝產(chǎn)物或蛋白質(zhì)結(jié)合的影響很小。此外,，對DNA施加外力能夠提升化合物的結(jié)合親和力并增加配體嵌入數(shù)量,，提高檢測靈敏度。因此,，單分子操縱技術(shù)提供了一種無需純化,、高靈敏度和高特異性的新方法，用于挖掘微生物來源的DNA嵌入劑,。
本研究通過單分子結(jié)合換液的方法分析了來自17個不同種的微生物培養(yǎng)物,，包括革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌和真菌,，成功篩選出兩種產(chǎn)DNA嵌入劑的菌株：Streptomyces tanashiensis 與 Talaromyces funiculosus,。通過次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇分析、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)以及化學分離等手段,，鑒定了三種DNA嵌入劑,，merdemycin，kalafungin和ligustrone B, 其中,，kalafungin和ligustrone B是首次證實具有DNA嵌入活性的天然產(chǎn)物,。本研究結(jié)果表明單分子力譜方法在活性天然產(chǎn)物挖掘中具有很好的應用前景。此外,，值得注意的是，磁性鑷子與微流體流動室的集成允許緩沖交換,，使其非常適合測量同一室中的多個樣品,。這展示了單分子操縱技術(shù)可以有效處理復雜樣品的能力，包括那些可能含有具有遺傳毒性風險的DNA插入物的樣品,，強調(diào)了其在環(huán)境監(jiān)測應用中的適用性,。
圖2. 單分子磁鑷實驗篩選產(chǎn)DNA嵌入劑的菌株。
華中科技大學藥學院碩士研究生劉天宇和蔡騰為共同第一作者,，蔡曉鳳教授和游慧娟教授為共同通訊作者,，中國科學院微生物研究所劉宏偉研究員,，山東大學李愛英教授，華中科技大學萬落生教授,，盧瑤副教授也參與了該研究,。
原文鏈接：https://doi.org/10.1093/nar/gkae746
Force-enhanced sensitive and specific detection of DNA-intercalative agents directly from microorganisms at single-molecule level
Tianyu Liu?, Teng Cai?, Junfeng Huo, Hongwei Liu, Aiying Li, Meng Yin, Yan Mei, Yueyue Zhou, Sijun Fan, Yao Lu, Luosheng Wan, Huijuan You*, and Xiaofeng Cai*
Nucleic Acids Res., 2024, Aug 28:gkae746. DOI: 10.1093/nar/gkae746.
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